Воздействие инфракрасного излучения
Оптическая стимуляция позволила добиться значительных успехов в изучении функции мозга и других биологических процессов. При этом она имеет крайне широкий потенциал терапевтического применения, начиная с восстановления слуха и заканчивая нормализацией работы сердечного ритма. В частности, импульсная лазерная стимуляция с использованием инфракрасных волн длиной > 1,5 мкм способна напрямую стимулировать нервы и мышцы без какого-либо предварительного генетического или химического вмешательства, что может быть использовано в терапии. Однако механизм инфракрасной стимуляции был загадкой, что препятствовало ее внедрению в клиническую практику.
В данной работе авторы демонстрируют, что инфракрасный свет возбуждает клетки посредством ранее неизвестного, общего для различных клеток электростатического механизма. Инфракрасные импульсы поглощаются водой, что приводит к быстрому локальному повышению температуры. Подобное нагревание обратимо изменяет электрическую емкость плазматической мембраны, приводя к ее деполяризации. Данное изменение потенциала полностью обратимо, а для его реализации достаточно лишь наиболее основных физико-химических свойств клеточных мембран.
Результаты исследования подчеркивают общеприменимость импульсной инфракрасной стимуляции и ее медицинский потенциала.Введение
Оптические технологии, которые обеспечивают точную локальную активацию нервной или мышечной активности, играют все более важную роль в нейробиологии и разработке методов лечения неврологических, психиатрических и сердечно-сосудистых заболеваний. Большинство таких технологий требуют сенсибилизации целевой ткани с использованием светочувствительного гена или химического агента, что увеличивает техническую сложность и риск их применения, особенно в условиях клиники.
Напротив, импульсный инфракрасный лазерный свет, как было показано, способен стимулировать нейроны и другие возбудимые клетки in vivo без какой-либо предварительной генетической или химической подготовки. Исследования можно проводить минимально инвазивно, так как излучение с требуемой длиной волны можно передавать посредством оптического волокна. Инфракрасную стимуляцию можно использовать для воздействия на двигательные ветви спинномозговых и черепных нервов, кавернозные нервы предстательной железы, преддверно-улитковый нерв и миокард. Простота использования прямого инфракрасного возбуждения делает этот метод привлекательным для использования в широком круге научных и клинических ситуаций, начиная с восстановления слуха и заканчивая нормализацией работы сердца.
Исследования на животных предоставляют все увеличивающееся количество доказательств того, что инфракрасная стимуляция может быть использована для модуляции различных биологических функций. Несмотря на это, механизм ее действия до конца не изучен. Было показано, что инфракрасная стимуляция сопровождается быстрым повышением температуры ткани, которое, предположительно, возбуждает клетки, воздействуя на ионные каналы и активируя внутриклеточные вторичные мессенджеры, тем самым увеличивая проводимость мембраны. Прямых доказательств в пользу одного из предполагаемых механизмов до сих пор получено не было. Отчасти так произошло потому, что в большинстве экспериментов с инфракрасной стимуляцией исследовались ее конечные эффекты (например, генерация потенциала действия и сокращение мышц), а не промежуточные электрофизиологические изменения в клетках-мишенях.
Авторы исследования изучили механизм инфракрасной стимуляции ооцитов Xenopus laevis, культивируемых клеток млекопитающих и искусственных липидных бислоев, и описали ранее неизвестный общий механизм, при котором инфракрасные лазерные импульсы, поглощаемые водой, приводят к быстрому локальному повышению температуры, что временно увеличивает электрическую емкость мембраны, и приводит к ее деполяризации. Это открытие поможет в дальнейшем изучении инфракрасной стимуляции нервной системы и других органов и вызывает вопросы о влиянии других видов светового излучения на сигнализацию клеток.
Результаты
Инфракрасный свет вызывает деполяризующие токи в ооцитах X. laevis
Большой размер ооцитов X. laevis (~1 мм) позволяет осуществить одновременную запись электрофизиологических параметров и оптическую стимуляцию, при этом риск возникновения фотоэлектрических артефактов остается минимальным. Основываясь на предыдущих результатах, свидетельствующих о том, что инфракрасное излучение увеличивает возбудимость клеток, авторы стимулировали подготовленные ооциты, экспрессирующие потенциалзависимые натриевые (Na+) и калиевые (K+) каналы, инфракрасными лазерными импульсами. Вопреки ожиданиям, наблюдаемый эффект не зависел не только от типа ионных каналов, но и от экспрессии каналов вообще: он сохранялся даже при стимуляции ооцитов дикого типа (которые экспрессируют гораздо меньше ионных каналов, чем подготовленные).
Инфракрасный свет вызывает деполяризующие токи в клетках млекопитающих
Чтобы определить, была ли реакция ооцитов на стимуляцию уникальной для этого типа клеток, исследователи провели эксперименты по инфракрасной стимуляции клеток линии HEK. Лазерные импульсы 200 мкс (0,7 мДж) и 1 мс (3,7 мДж) вызывали мембранные токи, подобные тем, которые наблюдались в ооцитах. Максимальные амплитуды тока 73 ± 20 пА наблюдались с импульсами 1 мс. Из-за небольшого размера клеток линии НЕК по отношению к диаметру оптического волокна и глубине проникновения света, как ячейка, так и записывающая пипетка облучались световыми импульсами. Однако замена H2O во внеклеточном растворе на D2O уменьшала наблюдаемую реакцию тока в клетках НЕК на 75,8 ± 12,6 %.
Инфракрасный свет изменяет емкость искусственных бислоев
Наблюдение за индуцированными токами в ооцитах и клетках линии НЕК и отсутствие изменения реакции при добавлении блокаторов каналов и транспортеров привели авторов к мысли о том, что за такую реакцию на стимуляцию отвечает общий для всех типов мембран механизм. В частности, авторы отметили, что реакция зависит не от абсолютного показателя температуры, а от скорости ее изменения. Это позволило предположить, что температура изменяет электрическую емкость мембраны, создавая ток, пропорциональный производной емкости.
Обсуждение
Потенциальная польза инфракрасной стимуляции была продемонстрирована многочисленными исследованиями in vivo, но отсутствие знаний о лежащих в ее основе механизмах препятствовало прогрессу в отношении важных научных и клинических применений. Авторы этого исследования обнаружили важный, ранее неизвестный механизм инфракрасной стимуляции, обусловленный переходными изменениями электрической емкости мембран.
Все три модели демонстрировали сходные электрофизиологические реакции на инфракрасную стимуляцию, вызванную лазерным импульсом. Эти токи были полностью обратимы и легко воспроизводимы. После нормализации данных по энергии импульса, изначальному заряду мембраны и приблизительной площади облучения, изменение заряда мембраны оказалось сходным у ооцитов, клеток линии НЕК и искусственных бислоев. Эти данные свидетельствуют о том, что в этих трех системах работает общий механизм изменения электрической емкости мембраны, а для достижения эффекта необходимы только самые основные элементы клеточной мембраны, представленные искусственным бислоем. В соответствии с этим заключением становится понятно, почему реакция ооцитов не изменялись при активной работе потенциалзависимых каналов и не нивелировалась при обработке клеток блокаторами ионных каналов.
Токи во всех трех системах значительно уменьшились при замене H2O на D2O. Это непосредственно подтверждает, что вода является основным хромофором, участвующим в инфракрасной стимуляции мембраны клеток. Временной профиль водно-опосредованных изменений температуры показывает ее быстрое, близкое к линейному нарастание во время лазерного импульса, за которым следует более медленный экспоненциальный спад, согласующийся со временем отдачи тепла водой.
Литература по оптической стимуляции клеток упускала из виду возможность емкостного механизма. Однако температурное изменение емкости мембран неудивительно, если учесть их физические свойства. Емкость определяется ионами, расположение которых вблизи мембраны зависит от баланса электрических и тепловых сил. Таким образом, реализация классической теории двухслойных конденсаторов породила прогнозы, которые в значительной степени подтвердили данные в искусственных бислоях и согласуются с ранними работами над гигантскими аксонами кальмаров, показывающими, что более высокие температуры привели к увеличению емкости мембран, и наблюдение, что индуцированные светом скачки температуры в ооцитах вызывали токи смещения заряда. Полученные результаты не исключают возможности того, что другие потенциальные явления изменения емкости, такие как изменения механического давления, также играют определенную роль. Такие потенциальные вклады потребуют дальнейшего изучения.
